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Anwendung der PCR-Methode im oncgnostics-Labor

Die Methode der PCR (= Polymerase chain reaction) steht für die Polymerase-Kettenreaktion. Das dahinterstehende Verfahren hat die medizinische und biotechnologische Forschung grundlegend verändert und gilt heute als wichtigste Labormethode zur Untersuchung der molekularen Struktur unserer Erbsubstanz (= DNA). Das liegt unter anderem daran, dass die PCR Methode vielseitig einsetzbar ist. Sie findet in allen oncgnostics-Projekten Anwendung und ist elementarer Bestandteil unseres Tests auf Gebärmutterhalskrebs GynTect. Bekanntheit erreichte der PCR Labortest zuletzt jedoch durch seinen Einsatz beim aktuell weltweiten Testen von Corona-Proben.

Wofür wird die PCR angewendet?

Labore verwenden die Methodik für die Vervielfältigung von DNA in kürzester Zeit. Schnelldurchläufe, sogenannte Fast-PCRs, erfolgen innerhalb von 10 Minuten. Andere dauern zwischen einer und zwei Stunden.

Nehmen wir unseren Gebärmutterhalskrebstest GynTect: Ziel der PCR ist hierbei herauszufinden, ob bestimmte, epigenetisch veränderte Gensequenzen vorliegen, die nur in Krebszellen vorkommen. Diese werden als methylierte DNA bezeichnet.

Um diese Frage via PCR-Diagnostik zu klären, benötigt man Folgendes:

  • DNA von der Probe, die untersucht wird. Die Probe sendet die gynäkologische Praxis ein, in der die betroffene Frau betreut wird.
  • Nukleotide: Das sind die chemischen Grundbausteine der DNA. Sie braucht es, um Kopien des vorgegebenen DNA-Strangs herzustellen.
  • Polymerasen: Dabei handelt es sich um eine Enzymklasse, die essentiell für die Vervielfältigung der DNA ist.
  • Spezifische Primer: Die künstlich erzeugten, kurzen Nukleotidketten dienen als Startmoleküle für die Polymerase. Sie docken an dem DNA-Strang an und kennzeichnen so den Punkt, an dem die Polymerase mit ihrer Arbeit beginnt. Je nachdem, welche Regionen (= Biomarker) der DNA es nachzuweisen gilt, dienen andere Primer als Schlüssel für die PCR-Methode.
  • Schließlich braucht es eine Puffer-Lösung, in der die Reaktion abläuft und die den pH-Wert stabil hält.

Polymerase Kettenreaktion: Ablauf im Thermocycler

Die Vervielfältigung der DNA erfolgt in der Regel in drei Schritten in einem sogenannten Thermocycler. Dieses Laborgerät regelt die exakten Temperaturen während der biochemischen Reaktion.

  1. Der erste Schritt heißt Denaturierung. Die Probe wird dabei auf 94-96°C erhitzt. Dies führt dazu, dass sich die beiden Stränge der doppelsträngigen DNA voneinander lösen.
  2. Für die zweite Phase der Primerhybridisierung wird die Probe rasant auf 50-65°C abgekühlt. Die jeweilige Temperatur hängt von den eingesetzten Primern ab, die wie oben beschrieben als spezifische Schlüssel dienen. Die Primer docken nun an den jeweils passenden Stellen der beiden Einzelstränge der DNA an.
  3. Im finalen Schritt der Elongation, auch Verlängerung genannt, werden aus den Einzelsträngen der DNA wieder Doppelstränge. Dafür wird die Temperatur erneut auf 68-72°C erhöht. Die Polymerase setzt an den kleinen Stellen doppelsträngiger DNA an, die durch die Primer entstanden sind. Mithilfe der losen Nukleotide vervollständigt sie den Doppelstrang.

Innerhalb von 30 Sekunden bilden sich in der letzten Phase etwa 500 Basenpaare. Die Länge des dritten Schritts hängt davon ab, wie lang die untersuchte DNA-Sequenz ist. Sobald der dritte Schritt abgeschlossen ist, startet ein neuer PCR-Zyklus. Dadurch vermehrt sich die DNA in den Bereichen der nachzuweisenden Marker exponentiell. Bereits nach 30 Zyklen können über eine Milliarde Kopien vorliegen. Der gesamte Ablauf dauert in der Regel eine Stunde.

Wichtig: Die Vervielfältigung der DNA-Probe passiert nur, wenn sie die gesuchte Gensequenz enthält. Im Fall von GynTect oder auch Corona wäre die DNA-Probe in diesem Fall positiv.

PCR Diagnostik: Was passiert bei der Anwendung von GynTect? 

Bei der Durchführung von GynTect wenden wir das beschriebene Verfahren an. Falls eine Methylierung der DNA für die entsprechende Gensequenz vorliegt, die ausschließlich in Krebszellen und Krebsvorläuferzellen vorkommt, kann die DNA mithilfe der spezifischen GynTect-Primer vervielfältigt werden. Das Ergebnis ist positiv. In diesem Fall leuchtet die Probe auf.

Für das optische Signal wenden wir einen bestimmten Fluoreszenzfarbstoff an. Dieser lagert sich in den aufeinanderfolgenden Zyklen immer wieder in doppelsträngige DNA-Stücke ein, die die PCR erzeugt. Je mehr vervielfältige DNA vorhanden ist, desto stärker ist das Leuchtsignal. Der Zyklus, ab dem das entstehende Leuchtsignal signifikant das Hintergrundleuchten überschreitet, wird als Cycle Threshold, auch Ct-Wert bezeichnet. Für den GynTect Test ist ein bestimmter Anteil methylierte DNA mindestens notwendig, damit eine Probe als positiv erkannt wird. Der Anteil liegt jedoch bei weniger als einem Prozent.

Ist die Probe negativ, wird keine Methylierung der DNA nachgewiesen. Die PCR erzeugt in diesem Fall keine DNA-Fragmente und der Farbstoff lagert sich nirgends ein. Dementsprechend gibt die Probe kein Leuchtsignal ab.

Die Vorbereitung der PCR für GynTect sehen Sie in diesem Video im Schnelldurchlauf.

Vorteil und Geschichte der PCR-Methode

Der klare Vorteil der Methode liegt in der einfachen Handhabbarkeit. Das Tool weist unkompliziert und zielgerichtet bestimmte Erbinformationen nach. Zentral ist hierbei, dass die Primer die Zielsequenz spezifisch erkennen. Im Beispiel von GynTect wenden wir Primer an, die nur auf bestimmte, in diesem Fall sechs verschiedene, Genregionen passen und das ausschließlich dann, wenn diese vorher methyliert vorlagen.

Die Forschung zu der Diagnostik-Methode geht bis in die 1950er Jahre zurück. In ihrem heutigen Sinn wurde sie 1983 erfunden und bereits 10 Jahre später, 1993, mit dem Chemienobelpreis ausgezeichnet. Heute sind in den meisten Laboren viele verschiedene PCR-Thermocycler im Einsatz. In einem früheren Blogbeitrag haben wir gezeigt, wie genau unser Labor und der Arbeitsalltag in diesem aufgebaut ist.

Jena, 20. Februar 2019 – Der Test zur Früherkennung von Gebärmutterhalskrebs GynTect kann nun auch auf dem weit verbreiteten PCR-System cobas Z480 Analyzer von Roche Diagnostics durchgeführt werden. Das ermöglichte eine Erweiterung der CE IVD Zulassung (CE Kennzeichnung für In-vitro Diagnostika). Entwickler und Anbieter von GynTect ist das Biotech-Unternehmen oncgnostics GmbH.

GynTect klärt schnell und zuverlässig, ob bei einer Patientin mit einem auffälligen Befund beim Pap-Abstrich oder einer HPV-Infektion tatsächlich ein zu behandelnder Gebärmutterhalskrebs entsteht oder vorliegt. Im Abstrich der Patientin weist GynTect methylierte, also veränderte, DNA-Regionen nach. Die Methylierung der GynTect-Biomarker tritt speziell bei Gebärmutterhalskrebs auf.

Die Durchführung von GynTect mit dem Cobas Z480
Um GynTect durchzuführen sind zwei Schritte notwendig. Zuerst fixiert eine Bisulfitbehandlung die DNA-Methylierung im diagnostischen Material. Für die Detektion der Markerregionen ist eine PCR (Polymerase chain reaction) notwendig, wie sie beispielsweise mit dem PCR-System cobas Z480 Analyzer von Roche durchgeführt wird. Auf der Grundlage der daraus entstanden Daten werden dann im letzten Schritt die Ergebnisse des GynTect-Tests abgeleitet. Nur ursprünglich methylierte DNA Regionen werden bei der PCR amplifiziert. Das Verfahren nennt sich daher auch methylierungsspezifiische PCR (MSP).

Mehr Labore können GynTect durchführen
„Bisher konnte GynTect nur auf dem Abi 7500 Real-time PCR Gerät von Life Technologies durchgeführt werden. Durch die Erweiterung der CE IVD-Zulassung geht das nun auch auf dem PCR-System cobas Z480 von Roche Diagnostics. Durch die hohe Verbreitung des Gerätes haben nun viel mehr Labore ohne zusätzlichen Aufwand die Möglichkeit, GynTect durchzuführen”, sagte Alfred Hansel, Gründer und Geschäftsführer von oncgnostics.

Honorarfreies Pressematerial finden Sie hier:
www.oncgnostics.com/downloads
vimeo.com/243256803

Das LABorteam von oncgnostics

Das Labor ist ein sagenumwobener Ort. Hier wird im Verborgenen getüftelt, entwickelt und (lebens-)wichtige Ergebnisse hervorgebracht. Anlässlich des Welttags des Labors am 23. April wollen wir etwas Licht ins Dunkel bringen und Ihnen unsere wichtigste Arbeitsstätte vorstellen, die eigentlich aus drei Arbeitsstätten besteht:

  1. Das Labor für Forschung und Entwicklung (F&E)

Hier werden etwa 80% der Labortätigkeiten durchgeführt. Das betrifft die Weiterentwicklung unseres molekulardiagnostischen Tests GynTect sowie die Bearbeitung von Studienproben und sämtliche Qualitätskontrollen im Bereich der GynTect Herstellung. Weiterhin wird in diesem Labor an Entwicklungen gearbeitet, die zu weiteren Produkten führen sollen. Besonders intensiv arbeiten wir an der Entwicklung eines Tests zur Erkennung von Kopf-Hals-Tumoren.

  1. Das Produktionslabor

Hier stellen wir ausschließlich GynTect als Kit sowie seine dazugehörigen Komponenten her und lagern sie auch hier. Bisher macht das etwa 10% unserer Arbeit aus, Tendenz allerdings steigend. Sobald jedoch größere Bestellungen von GynTect Kits anfallen, weil beispielsweise die Nachfrage in den Märkten, für die wir kürzlich Vertriebspartnerschaften geschlossen haben, ansteigt, wird der Arbeitsaufwand hier schnell höher.

  1. Das PCR-Labor

Allgemein laufen in diesem Labor sämtliche Anwendungen der vorher genannten Labore auf den Geräten. Namensgebend für das Labor ist die “Polymerasekettenreaktion” (= engl. PCR). Diese findet hier zur Vervielfältigung von DNA statt. Auf diese Weise werden die GynTect-Biomarker genauso in den Proben nachgewiesen wie die Biomarker für unsere neuen Entwicklungen im Bereich Kopf-Hals-Tumore. Hier werden also unter Anderem auch eingegangene Proben mit GynTect getestet. Daraus ergeben sich erhöhte Sicherheitsvorkehrungen:

Hat eine Kollegin das PCR-Labor einmal betreten, so darf sie an diesem Tag nicht mehr in das Produktionslabor. Das liegt daran, dass im PCR-Labor die DNA-Vervielfältigung der Marker stattfindet. Die Komponenten und Chemikalien, die bei der Herstellung von GynTect im Produktionslabor zum Einsatz kommen, dürfen auf gar keinen Fall mit der DNA aus dem anderen Labor in Berührung kommen, es besteht hier Kontaminationsgefahr. Mit dieser Regelung werden also die im Produktionslabor hergestellten GynTect Kits absolut sauber gehalten.

Wenn jemand an einem Tag in die Produktion will, kann er zwar im F&E-Labor tätig sein und z.B. Pipettierarbeiten für GynTect durchführen. Aber er kann die Arbeit nicht im PCR-Labor ins Gerät stellen. Deshalb müssen wir uns gut untereinander absprechen. So kann jemand anderes, der an dem Tag nicht in der Produktion ist, diese Aufgabe erledigen.

Damit wir nicht durcheinander kommen, herrscht neben der Kittelpflicht im Labor auch die Kittel-Farben-Pflicht. Im F&E-Labor tragen alle weiße Kittel, im Produktionslabor sind rote Kittel Pflicht und im PCR-Labor werden grüne Kittel getragen.

Wichtige Arbeitsmittel im Labor

Trotz der immer schneller zunehmenden Automatisierung ist in allen Laboren die gute alte Pipette das am meisten genutzte Gerät. Darüber hinaus verwenden wir besonders häufig die sogenannten real-time PCR-Geräte. In diesen werden bestimmte Bereiche der DNA für die Durchführung von GynTect, aber auch für die Forschung und Entwicklung vervielfältigt.

Als Hersteller von Medizintechnik befolgen wir ein Qualitätsmanagement-System mit hohem Anspruch. Das bringt eine umfangreiche Dokumentationspflicht mit sich: so ist auch der Computer für das Labor eines der wichtigsten Arbeitsmittel.

Ohne Labor gäbe es auch oncgnostics nicht. Hier finden alle wichtige Prozesse statt, die das Unternehmen ausmachen: Entwicklung neuer Produkte, Durchführung von Studien, Produktion von GynTect Kits und Auswertung von Patientenproben. Für uns ist es der spannendste Arbeitsort, den wir uns vorstellen können.

Das Laborteam von oncgnostics.

Wer gerade in welchem Labor arbeitet, erkennt man an den Kittelfarben.