Anwendung der PCR-Methode im oncgnostics-Labor

Die Methode der PCR (= Polymerase chain reaction) steht für die Polymerase-Kettenreaktion. Das dahinterstehende Verfahren hat die medizinische und biotechnologische Forschung grundlegend verändert und gilt heute als wichtigste Labormethode zur Untersuchung der molekularen Struktur unserer Erbsubstanz (= DNA). Das liegt unter anderem daran, dass die PCR Methode vielseitig einsetzbar ist. Sie findet in allen oncgnostics-Projekten Anwendung und ist elementarer Bestandteil unseres Tests auf Gebärmutterhalskrebs GynTect. Bekanntheit erreichte der PCR Labortest zuletzt jedoch durch seinen Einsatz beim aktuell weltweiten Testen von Corona-Proben.

Wofür wird die PCR angewendet?

Labore verwenden die Methodik für die Vervielfältigung von DNA in kürzester Zeit. Schnelldurchläufe, sogenannte Fast-PCRs, erfolgen innerhalb von 10 Minuten. Andere dauern zwischen einer und zwei Stunden.

Nehmen wir unseren Gebärmutterhalskrebstest GynTect: Ziel der PCR ist hierbei herauszufinden, ob bestimmte, epigenetisch veränderte Gensequenzen vorliegen, die nur in Krebszellen vorkommen. Diese werden als methylierte DNA bezeichnet.

Um diese Frage via PCR-Diagnostik zu klären, benötigt man Folgendes:

  • DNA von der Probe, die untersucht wird. Die Probe sendet die gynäkologische Praxis ein, in der die betroffene Frau betreut wird.
  • Nukleotide: Das sind die chemischen Grundbausteine der DNA. Sie braucht es, um Kopien des vorgegebenen DNA-Strangs herzustellen.
  • Polymerasen: Dabei handelt es sich um eine Enzymklasse, die essentiell für die Vervielfältigung der DNA ist.
  • Spezifische Primer: Die künstlich erzeugten, kurzen Nukleotidketten dienen als Startmoleküle für die Polymerase. Sie docken an dem DNA-Strang an und kennzeichnen so den Punkt, an dem die Polymerase mit ihrer Arbeit beginnt. Je nachdem, welche Regionen (= Biomarker) der DNA es nachzuweisen gilt, dienen andere Primer als Schlüssel für die PCR-Methode.
  • Schließlich braucht es eine Puffer-Lösung, in der die Reaktion abläuft und die den pH-Wert stabil hält.

Polymerase Kettenreaktion: Ablauf im Thermocycler

Die Vervielfältigung der DNA erfolgt in der Regel in drei Schritten in einem sogenannten Thermocycler. Dieses Laborgerät regelt die exakten Temperaturen während der biochemischen Reaktion.

  1. Der erste Schritt heißt Denaturierung. Die Probe wird dabei auf 94-96°C erhitzt. Dies führt dazu, dass sich die beiden Stränge der doppelsträngigen DNA voneinander lösen.
  2. Für die zweite Phase der Primerhybridisierung wird die Probe rasant auf 50-65°C abgekühlt. Die jeweilige Temperatur hängt von den eingesetzten Primern ab, die wie oben beschrieben als spezifische Schlüssel dienen. Die Primer docken nun an den jeweils passenden Stellen der beiden Einzelstränge der DNA an.
  3. Im finalen Schritt der Elongation, auch Verlängerung genannt, werden aus den Einzelsträngen der DNA wieder Doppelstränge. Dafür wird die Temperatur erneut auf 68-72°C erhöht. Die Polymerase setzt an den kleinen Stellen doppelsträngiger DNA an, die durch die Primer entstanden sind. Mithilfe der losen Nukleotide vervollständigt sie den Doppelstrang.

Innerhalb von 30 Sekunden bilden sich in der letzten Phase etwa 500 Basenpaare. Die Länge des dritten Schritts hängt davon ab, wie lang die untersuchte DNA-Sequenz ist. Sobald der dritte Schritt abgeschlossen ist, startet ein neuer PCR-Zyklus. Dadurch vermehrt sich die DNA in den Bereichen der nachzuweisenden Marker exponentiell. Bereits nach 30 Zyklen können über eine Milliarde Kopien vorliegen. Der gesamte Ablauf dauert in der Regel eine Stunde.

Wichtig: Die Vervielfältigung der DNA-Probe passiert nur, wenn sie die gesuchte Gensequenz enthält. Im Fall von GynTect oder auch Corona wäre die DNA-Probe in diesem Fall positiv.

PCR Diagnostik: Was passiert bei der Anwendung von GynTect? 

Bei der Durchführung von GynTect wenden wir das beschriebene Verfahren an. Falls eine Methylierung der DNA für die entsprechende Gensequenz vorliegt, die ausschließlich in Krebszellen und Krebsvorläuferzellen vorkommt, kann die DNA mithilfe der spezifischen GynTect-Primer vervielfältigt werden. Das Ergebnis ist positiv. In diesem Fall leuchtet die Probe auf.

Für das optische Signal wenden wir einen bestimmten Fluoreszenzfarbstoff an. Dieser lagert sich in den aufeinanderfolgenden Zyklen immer wieder in doppelsträngige DNA-Stücke ein, die die PCR erzeugt. Je mehr vervielfältige DNA vorhanden ist, desto stärker ist das Leuchtsignal. Der Zyklus, ab dem das entstehende Leuchtsignal signifikant das Hintergrundleuchten überschreitet, wird als Cycle Threshold, auch Ct-Wert bezeichnet. Für den GynTect Test ist ein bestimmter Anteil methylierte DNA mindestens notwendig, damit eine Probe als positiv erkannt wird. Der Anteil liegt jedoch bei weniger als einem Prozent.

Ist die Probe negativ, wird keine Methylierung der DNA nachgewiesen. Die PCR erzeugt in diesem Fall keine DNA-Fragmente und der Farbstoff lagert sich nirgends ein. Dementsprechend gibt die Probe kein Leuchtsignal ab.

Die Vorbereitung der PCR für GynTect sehen Sie in diesem Video im Schnelldurchlauf.

Vorteil und Geschichte der PCR-Methode

Der klare Vorteil der Methode liegt in der einfachen Handhabbarkeit. Das Tool weist unkompliziert und zielgerichtet bestimmte Erbinformationen nach. Zentral ist hierbei, dass die Primer die Zielsequenz spezifisch erkennen. Im Beispiel von GynTect wenden wir Primer an, die nur auf bestimmte, in diesem Fall sechs verschiedene, Genregionen passen und das ausschließlich dann, wenn diese vorher methyliert vorlagen.

Die Forschung zu der Diagnostik-Methode geht bis in die 1950er Jahre zurück. In ihrem heutigen Sinn wurde sie 1983 erfunden und bereits 10 Jahre später, 1993, mit dem Chemienobelpreis ausgezeichnet. Heute sind in den meisten Laboren viele verschiedene PCR-Thermocycler im Einsatz. In einem früheren Blogbeitrag haben wir gezeigt, wie genau unser Labor und der Arbeitsalltag in diesem aufgebaut ist.